艾滋病病毒(HIV)侵入人体后可在感染细胞内复制, 并将其遗传物质整合于寄生细胞内 , 造成CD +4 T 淋巴细胞数量进行性减少 ,继而损害细胞免疫功能 ,最终导致各种机会性感染和肿瘤 。有关艾滋病病毒感染者/艾滋病患者(HIV/AIDS 患者)外周血淋巴细胞凋亡及与 CD +4 T 淋巴细胞计数间关系的相关研究仍处于探索阶段 。本文采用流式细胞技术初步探讨了 HIV/AIDS 患者外周血淋巴细胞凋亡的损伤特点及其与CD +4 T 淋巴细胞水平的相互关系。现将结果报告如下

1　 材料与方法

1.1　 对象　 (1)HIV 感染组为在高危人群筛检和本院初筛阳性并经新疆维吾尔自治区疾病预防控制中心 AIDS 监测中心确诊的单纯 HIV 感染者, 合计 86例 。均为静脉吸毒者, 平均年龄 25.4 岁(18 ～ 35岁),平均吸毒年限 6.5 年(1 月 ～ 14 年)。按临床和实验室诊断标准 [ 1] 分组, 其中 HIV 感染者 50 例 ,AIDS 患者 36例 。排除合并病毒性肝炎和其它免疫系统疾病及肿瘤 。(2)正常对照组为门诊体检合格者 ,经 HIV ELISA 和 Determin 1 +2 初筛均为阴性者 ,共计 54 名。平均年龄 28.1 岁(19～ 41 岁), 排除病毒性肝炎和其它各类免疫系统疾病。

1.2　 实验材料　 HIV ELISA 和 Determin 1+2 金标试剂分别购自北京威泰克(阿克苏)和美国雅培责任有限公司(上海)。配套的 CD 4 细胞计数试剂盒 、An-nexin V FITC/PI 凋亡检测试剂等原装试剂盒和专用 Falcon 上样管 ,均购置于美国 Becton-Dickinson 公司,并采用该公司 FACSCalibur TM 流式细胞仪进行检测。淋巴细胞分离液(进口分装)购置于上海恒信化学试剂有限公司 。

1.3　 实验方法 　 清晨空腹分别采集肘静脉抗凝血2ml ,EDTA-K 2 抗凝血用于 CD 3 CD 4 CD 8 检测, 并采用MultiSET 专用软件进行自动分析 ;肝素抗凝血用于细胞凋亡分析, 并采用 CellQuest 专用软件进行自动分析 。所有试验均按试剂盒说明书进行操作 ,在有效期内使用,并按试验要求同步设置空白对照、阴性对照、各种荧光标记物对照(未染色管 、FITC 染色管、PI 染色管)。试验前按仪器检测要求进行定标。

1.4　 统计处理　 依据资料性质, 采用华西医科大学PEMS3.1 统计软件包进行 F 检验及q 检验。

2　 结果

各对比组 CD +4 T 淋巴细胞计数和细胞凋亡检测结果见表 1。统计分析显示 ,各对比组中细胞凋亡百分率有统计学差异(F =898 ,P <0.01), 表现为AIDS 组 >HIV 感染组 >对照组(q 12 =46, q 13 =58, q 23 =12, P 均 <0.01);CD +4 T 淋巴细胞计数亦呈现出统计学差异(F =13 270, P <0.01),表现为对照组 >HIV 感染组 >AIDS 组(q 12 =33, q 13 =203, q 23 =185, P 均 <0.01)。

表 1　 各组别外周血淋巴细胞凋亡检测结果与分析(  x±s)

3　 讨论
CD +4 T 淋巴细胞是 HIV 攻击的主要靶细胞,HIV 感染可通过多种直接或间接的病理机制使CD +4 T 淋巴细胞数量进行性减少, 并使其功能受损。

减少的原因主要包括 HIV 直接杀伤细胞, HIV 诱导CD +4 T 淋巴细胞凋亡, 补体介导的细胞毒效应及抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。目前对细胞凋亡在 CD + 4 T 淋巴细胞减少中的研究较为突出 。

本文采用 Annexin V-FITC/PI 染色和流式细胞技术 ,初步探讨了 HIV/AIDS 患者外周血淋巴细胞(PBMC)凋亡与 CD +4 T 淋巴细胞水平的关系。结果显示,各组别细胞凋亡百分率有统计学差异, 表现为AIDS 组>HIV 感染组>对照组;CD+4 T 淋巴细胞计数亦呈现出统计学差异 , 表现为对照组 >HIV 感染组 >AIDS 组。

研究表明, HIV gp120 等抗原组份可与 CD 4 受体结合 ,直接激活受感染的 CD +4 T 淋巴细胞凋亡, 并通过“旁观者效应”触发大量未受 HIV 感染的 CD +4 T淋巴细胞发生凋亡 , 结果造成以 CD +4 T 淋巴细胞为中心的严重免疫缺陷, 此乃 HIV 感染导致 CD + 4 T 淋巴细胞数目减少的主要原因。

研究证明,HIV 感染者的淋巴细胞可表达高水平的 Fas, 而且感染者的淋巴细胞对 Fas(CD 95 )-FasL(CD 95L )诱导的细胞凋亡比非感染者的淋巴细胞更敏感 。HIV 感染中受到慢性激活的免疫状态可使细胞凋亡速率异常升高,并导致淋巴细胞自发凋亡水平随发病程度而提高 。同时HIV 的多种病毒蛋白也能诱导细胞凋亡 ,但作用机制各不相同 。Nef 可上调Fas 和 FasL 表达而诱导凋亡 [ 5] ,Tat 通过提高级联蛋白酶 caspase-8 的活性引起凋亡 [ 6] ,Vpr 则经 G 2 细胞周期锁定造成凋亡。

Tim [ 8] 临床体内实验显示, HIV 感染组 CD + 4 T淋巴细胞凋亡率为 18%,对照组为 8%。体外实验显示 ,HIV 感染组 CD +4 T 淋巴细胞凋亡率静态时为18%, 激活时为 38%;而对照组则依次 为 8%和10%。综合研究与分析表明, HIV 感染组 CD + 4 T 淋巴细胞凋亡水平明显高于非感染组 。

本文临床实验研究初步表明, HIV/AIDS 患者CD + 4 T 淋巴细胞水平与外周血淋巴细胞凋亡具有一定程度的关联性, 为进一步探索其致病机理, 评价疗效和预后等提供了有益的线索 。